생명과학 | Plasmid DNA를 이용한 제한효소 처리 및 유전공학 기초 이해
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작성자 캠프 담당자 작성일17-01-17 17:31 조회9,177회 댓글0건본문
1.실험목표
- plasmid DNA에 직접 제한효소를 처리할 수 있다.
- 젤 전기영동을 통해 제한효소 처리 결과를 보고 제한효소의 역할을 이해할 수 있다. 또한 결과를 통해 DNA map을 작성할 수 있다.
2. 실험재료
plasmid DNA, restriction enzyme, 10X reaction buffer(NaCl, TrisCl, MgCl2, Dithiothreitol, KCl 등), 10X PCR reaction buffer, 프라이머(10pmol), Taq polymerase, D.W, 10X reaction buffer, 1XTAE buffer, 아가로오즈 겔 파우더, gel red, DNA loading dye, DNA size marker(1Kb), spin column, lysis buffer, 70%에탄올, wash buffer
3. 실험기구
PCR 기기, micro pipet과 피펫 팁, 아이스팩, PCR tube, PCR tube rack, 1.5ml tube와 rack, 호일랩, 폴리글러브, 라텍스 글러브, Et-OH 분무기, 네임펜, 전기영동장치, UV light기, gel tray, microwave oven, 전자저울, 약수저, 삼각플라스크, 거름종이, 핸드페이퍼, 원심분리기
4. 실험방법 :
가. Polymerase Chain Reaction1. 전체 실험은 PCR 기기에 넣기 전까지 아이스팩 위에서 진행한다.
| Amount(μl) |
Template | 2 |
10X reaction buffer | 2 |
dNTPs | 2 |
primer1 | 1 |
primer2 | 1 |
Taq polymerase | 0.5 |
D.W | 11.5 |
Total mixture | 20 |
2. PCR tube에 아래 표와 같이 micro pipet으로 정밀하게 첨가해준다.
3. 1%의 gel을 만들기 위해서 40ml의 1X TAE에 0.4g의 Agarose gel가루를 넣고 hot plate에 2분 정도 돌려 투명하게 녹인다.
사진1. 0.1% Agarose gel을 만들기 위해 0.5g의 agarose를 재고 있다.
사진2, 3. TAE buffer에 Agarose gel 파우더를 녹여0.1% Agarose gel을 만드는 모습이다.
4. 투명하게 녹은 gel에 gel red를 넣고 공기방울이 생기지 않도록 조심하며 gel 성형 틀에 붓는다. gel의 위쪽에 콤을 끼워준 후 gel이 굳을 때까지 20분 정도 기다린다.
사진4. 만들어진 gel의 모습이다.
5. 전기영동 기기에 1X TAE를 채운 뒤 굳은 gel을 넣어준다. 제일 앞 홈에 DNA size marker를 2μl 넣는다.
사진5. 가공된 DNA에 loading를 추가하는 모습이다.
사진6. 전기영동 gel에 loading하고 있다.
6. 2μl씩 loading dye를 증폭 산물에 섞어 총 22μl를 전기영동 gel 홈에 차례대로 넣는다.
7. gel을 100-150V로 30분정도 내리고 UVlight에 쬐여 결과를 확인한다.
사진7. 전기영동 결과를 UVlight를 이용하여 확인하고 있다.
사진8. 전기영동 결과이다.
나. 제한효소작용 확인
| sample1 (μl) | sample2 (μl) |
Plasmid DNA | 1 | 1 |
10X buffer | 1 | 1 |
Restriction Enzyme | BamHI : 0.5 | BamHI : 0.5 |
|
| EcoRI : 0.5 |
D.W | 7.5 | 7 |
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