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의과학 | Bradford method를 이용한 단백질 정량

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작성자 캠프 담당자 작성일17-07-08 19:28 조회167회 댓글0건

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국립중앙과학관 세종과학실험 토론캠프

Bradford method를 이용한 단백질 정량 

 

 

1.실험목표

특정 단백질을 흡광도를 이용하여 정량하고 단백질 정량하는 방법에는 어떤 것들이 있으며 그 차이점을 이해, 또한 시약 제조 및 농도 계산법을 이해하도록 한다.
 

 

 

2. 실험재료

Na2CO3, NaOH, CuSO4.5H2O, Potassuim Tartarate (각 시약 1), 증류수(말통 하나), BSA(Bovine serum albumin - 1), folin-phenol regent (1), Na3C6H5O72H2O

 

 

 

 

3. 실험기구

spectrophotometer elisa plate reader (1), 전자저울 (1), Micro pipet(1000ul, 100ul, 10ul & 각 팁 조당 1& 1box), vortex (반에 1), microtube(1.5ml -2봉지), tube rack (조당1개씩), 15ml tube, 50ml tube(조당 4개씩), 라텍스(1반에 1Box), 네임펜 (조당 1), 노트북 (반에 1), pipet(10ml 각 조당 3개씩)

 

 

4. 실험방법 

 

<Lowry method>

 

1. 시약 만들기

- Reagent A : 1gNa2CO3 in 0.2gNaOH in dw 50ml

- Reagent B : 0.1g CuSO4.5H2O, 0.2gNa3C6H5O72H2O

in 20 ml distilled water

- Reagent C : 0.2 g Potassuim Tartarate in 10ml distilled water

 

 

2. 위의 reagent A: 9.8 ml B : 0.1 ml , C : 0.1 ml을 차례로

15 ml tube에 넣고 섞어준다.

 

 

3. E-tubeprotein양을 정확히 알지 못하는 milk를 희석한다

(20ul가 되게 함)

sample A - 1/2: DW 10ul + milk 10ul

sample B - 1/5: DW 12ul + milk 8ul

sample C - 1/10: DW 10ul + 1/5 10ul

sample D - 1/50: DW 16ul + 1/10 4ul

  

 

4. BSAstandard 를 만든다. ( stock : BSA 1mg/ml )

 

0.5mg/ml

1 mg/ml

2 mg/ml

3 mg/ml

4 mg/ml

BSA []

0

20

40

60

80

H2O []

200

180

160

140

120

[]

200

200

200

200

200

 

 

5. standardsample96well2ul씩 넣는다. 

 

 

4a6230e7efc7ca71c7cfdf2a00aa3b8a_1499509

 

<그림1. 희석된단밸질과 lowry와 뷰렛시약을 etube에 준비하는 모습이다. >

 

 

6. standard sample 에 위에서 만든 solution 178ul 씩 넣고 vortexing 한다.

 

 

7. room temp.에서 15분간 방치한다.

 

 

8. folin-phenol reagentD.W1:1 dilution 하여 (400ul : 400ul) 하여 800ul을 만든다.

 

 

9. standard samplefolin-phenol reagent20ul 를 가하고 바로 vortexing 한다. (Total volume 200ul)

 

 

10. room temp.에서 30분간 방치한다.

 

 

11. Elisa reader660 nm에서 흡광도를 잰다.

 

 

12. standard curve를 그리고, 단백질량을 계산한다.

 

 

 

<Bradford method>

 

1.BSAstandard 를 만든다. ( stock : BSA 1mg/ml ) 

 

 

0.5 mg/ml

1 mg/ml

2 mg/ml

3 mg/ml

4 mg/ml

BSA []

0

20

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