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의과학 | 마우스 간으로부터 glycogen 검출 및 효소의 특성 검정 (카탈라제)

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작성자 캠프 담당자 작성일17-08-24 15:54 조회99회 댓글0건

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국립중앙과학관 세종과학실험 토론캠프

 

 마우스 간으로부터 glycogen 검출 및 효소의 특성 검정 (카탈라제)

 

 

 

1.실험목표

 

혈액중 혈당과 비타민측정을 통해 인체가 가지고 있는 항상성을 이해해 본다.

 

 

 

 

2. 실험재료

 

Balb/c mouse, Ethyl ether, 70% 알코올, EDTA, sodium citrate, 증류수혈당측정기 (글루코렙혈당측정지), , DPIP (2,6-dichlorophenolindophenol) C12H6Cl2NO2Na(MW290.1g/mol), 비타민 C(L-Ascorbic acid) (MW 176.13 g/mol) , 1% oxalic acid (MW 126.07 g/mol),오렌지 주스(미닛메이드)

 

 

 

 

 

3. 실험기구

2ml syringe, 비커해부기 세트마이크로 파이펫 (20 P, 100 P) 및 tip, micro tube (1.5ml) 및 rack, 1회용 스포이드, 1.5ml 원심분리기, , Vortex,15ml 튜브시험관대스포이트해부용가위핀셋해부용페트리디쉬비이커, hot plate, 깔대기삼각플라스크100ml (2), 메스실린더 10ml (1), 부피플라스크 100ml(2), 피펫3흰종이

 

 

 

4. 실험방법   

 

글리코겐 측정

 

1. 탈지면에 디에틸에테르를 적셔 50ml conical tube에 넣고 쥐의 호흡기를 넣어 마취 시킨다.

 

2. 쥐를 복부가 위를 향하도록 해부판 위에 두고, 발을 핀으로 단단히 고정한다. 여기서 핀으로 고정할 때 45° 바깥쪽을 향하게 꽂는 것이 중요하다. 왜냐 하면 수직으로 꽂았을 경우 Rat이 마취에서 깨어나 몸을 심하게 움직이면 핀이 빠질 수 있기 때문이다.

 

3. 우선 생식기 위의 복부를 핀셋으로 잡고 바깥쪽에서 안쪽으로 가위를 사용해서 아래 그림 a-c 순서로 자른다. 여기서 사용하는 해부용 가위는 한쪽은 뭉툭하고 한쪽은 뾰족한 가위인데 해부할 때에는 항상 뭉툭한 곳이 안쪽을 향하도록 해야 한다. 왜냐하면 뾰족한 곳이 안쪽을 향하게 되면 안의 장기가 파괴되어 관찰이 어려워지기 때문이다. 

 

4. 흠집을 내면 제일 먼저 가죽이 잘라지고 그 안의 얇은 피부층 까지 잘라야 내장을 관찰할 수 있다. 흠집이 난 부위를 시작해서 양 옆으로 자른 후 머리 쪽으로 배를 가른다. 올라가 보면 간을 지나 막을 하나 발견 할 수 있다. 그 막이 횡격막이다. 횡격막의 양쪽 을 잘라 제거하고 다음은 늑골을 펼쳐야 한다. 늑골의 중심은 단단하기 때문에 잘 잘라지지 않는다. 그래서 늑골 옆의 늑연골을 잘라서 올라간다. mouse의 목 부분까지 자른 다음 그 부위에서 양옆으로 자른다. 그 다음 양옆으로 펼쳐서 핀으로 45° 바깥쪽을 향해 꽂아 고정시킨다.

 

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사진1. 간조직 적출을 위해 마우스 해부를 하는 모습이다.

 

 5. , , 근육을 적출한다.

6. 미리 50 ml conical tube의 무게를 측정하여 튜브에 표시를 한다.

7. 50ml conical tube에 적출된 Rat의 간, , 근육을 넣고 무게를 잰다. 그 후 ice-cold 5% TCA 용액을 각

5 ml 씩 넣는다.

 

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사진2. 마우스로부터 간조직을 채취하는 모습이다. 

 

8. spatula를 이용하여 homogenization 한다. 이때 보다 높은 수득률을 얻기 위해서 최대한 잘게 부순다.

 

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사진3. TCA용액을 넣은후 막자사발로 잘게 부순 모습이다.

9. 상온에서 5분간 방치하여 침전시킨 후 상층액을 15 ml conical tube에 옮긴다.

10. 3,600 rpm에서 5분간 원심분리 한다. 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 넣는다.

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사진​3. TCA용액을 넣은후 원심분리하여 단백질을 침전한 모습이다.

11. 2.5배의 95% EtOH를 넣는다조심스럽게 튜브를 위아래로 섞어주며 침전물을 확인한다.

 

12. 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 한다. 


13. 상층액을 조심스럽게 버리고 상온에서 5분간 샘플을 말린다.

 

14.  무게를 재어 Glycogen의 수득률(추출한 glycogen의 무게/장기의 무게 X 100)을 계산한다.

 

15. Iodine test (요오드 검정)을 통해 황갈색을 확인한다.

 

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사진​4. 에탄올로 반응시켜 글리코겐을 침전시킨 모습이다.

 

 

카탈라제 실험

 

1.  5개의 시험관 윗부분에 각각 A-E의 라벨을 붙인다.

 

2. 각 시험관에 3% 과산화수소 용액을 2mL씩 넣는다.

 

3. 시험관 A에는 이산화망간 0.5g을 넣고, 시험관 B에는 간0.5g을 잘게 으깨어 넣는다.


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사진​5. 이산화망간을 튜브에 넣는 모습이다.

 

4. 시험관 C에는 끓는 물 속에 두었던 이산화망간 0.5g, 시험관 D에는 끓는물 속에 두었던 간 0.5g

넣는다.

 

5. 시험관 E에는 아무것도 넣지 않는다.

 

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사진​6. 과산화수소를 넣어 효소반응을 시키는 모습이다.

 

6. 각 시험관에서 발생되는 기포를 관찰한다.

 

7. 거품이 생기는 시험관에 선향의 불씨를 대어보고 변화를 관찰한다.


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사진​7. 튜브에 발생한 기포에 향을 넣어서 반응시키는 모습이다.


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