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의과학 | Carrageenan (겔화제) 를 이용한 급성 염증 마우스 모델에서 염증조절인자의 PCR기법을 이용한 증폭

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작성자 캠프 담당자 작성일17-08-24 16:04 조회98회 댓글0건

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국립중앙과학관 세종과학실험 토론캠프

 

 Carrageenan (겔화제) 를 이용한 급성 염증 마우스 모델에서 염증조절인자의 PCR기법을 이용한 증폭

 

 

 

 

1.실험목표

 

염증반응은 외부 또는 내부로부터의 손상으로부터 이를 방어하는 생물의 기작이다. 염증반응 동물모델의 제작과 염증반응 검사를 위한 PCR반응을 통해 염증반응을 이해해보자

 

 

 

 

2. 실험재료

 

8주령 마우스 2마리, λ-carrageenan, 생리식염수, 에틸에테르, RNA extraction kit, PCR kit, microtube,

micropipet, microtube rack, glove

 

 

 

 

 

3. 실험기구

 

해부판, 해부도구, 수술용 실, 알콜, 1ml 3ml 주사기, 시침핀, 은박지, 비커, DNA 전기영동 장치(반에 1), UV light(반에 1), gel tray(반에 1), microwave oven(반에 1), 전자저울(반에 1), 약수저(반에 1), 삼각 플라스크(반에 1), 거름종이, micro pipet (20P, 10P, 100P 조당 1대씩), 각 팁(yellow tip, white tip조당 1box), PCR tube, PCR tube rack(조당 1), 호일랩(반에 1), water bath(반에 1), 폴리글러브 (한 수업당 1box)

 

 

 

4. 실험방법    

 

<급성염증반응 마우스 유도>

 

1. 준비된 마우스를 ether또는 포란액을 이용해 마취를 한다.

 

2. 한손으로 마우스를 눕혀 잡는다.

 

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사진1. 마우스를 눞혀잡고 족부에 카라지난을 놓는 모습이다 

 

3. 생리식염수에 1%의 농도로 λ-carrageenan을 용해 시킨다

 

 

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사진​2. 족부에 염증유발을 위해 카라지난을 준비한 모습이다

 

4. 0.2 mL를 흰쥐의 오른쪽 뒷발 발바닥 중심부 피하에 주사하였다.

 

5. 약 한시간 반후 반복하여 카라지난을 투여한다.

 

6. 염증반응이 유발되는지 잘 관찰한다.

 

 

 

 

<RNA추출>

 

1. 5mmX5mm로 자른 조직을 잘게 썰어서 etube에 넣고 lysis 버퍼에 넣고 56에서 15분간 반응시킨다.

 

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사진3. 염증부위근육을 적출하여 e튜브에 옮기는 모습이다

 

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사진4. 조직에 lysis 버퍼를 넣고 반응시킨 모습이다

 

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사진5. 56에서 조직을 반응시킨 모습이다.

 

2. 상층액을 spin column에 넣고 원심분리를 한다.

 

3. 70% 에탄올을 넣고 원심분리를 한다.

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사진​6. 에탄올을 넣고 분리한 모습이다.

 

4. wash 버퍼로 2회 원심분리를 통해 원심분리를 한다.

 

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사진​7. wash버퍼를 넣고 원심분리를 하는 모습이다.

 

5. 멸균된 증류수를 약 20ul넣고 약 2분간 반응시킨다.

 

6. 원심분리후 RNA를 추출한다.

 

 

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사진​8. 원심분리를 통해 RNA를 분리한 모습이다.

 

 

PCR (Polymerase Chain Reaction)

 

1. 모든 용액은 사용할 때까지 ice에 둔다.

 

2. PCR tube에 아래 표와 같이 micro pipet으로 정밀하게 첨가해준다.

 

 

Amount

Template

2

10X reaction buffer

2

dNTPs(2.5mM)

2

primer 1 (10 pmoles)

1

primer 2 (10 pmoles)

1

Taq polymerase

0.5

D.W.

11.5

Total mixture

20

 

3. ice위에 reaction mixture를 천천히 resuspend 해준다.

 

4. PCR기기에 sample tube들을 넣어주고 조건에 맞게 setting하여 start 해준다.

 

< 주의할 점 >

* prepare the reaction mixture on ice.

* Minimize the possibility of pipetting errors.

* Each template DNA was serially diluted.

(1/10 dilution, 1/100 dilution, 1/1000 dilution)

* Reaction condition

95

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