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생명과학 | PCR기법을 활용한 질병진단(제2형 당뇨병)

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작성자 캠프 담당자 작성일18-11-21 15:52 조회460회 댓글0건

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​국립중앙과학관 세종과학실험 토론캠프​​

 

PCR기법을 활용한 질병진단(제2형 당뇨병) 

 

1. 실험목표

PCR과 전기영동 기법을 직접 수행하여 과정과 원리를 이해한다. 당뇨병을 정확히 이해하고, GLUT4 유전자의 발현농도에 따라 당뇨병을 진단한다.

2. 실험재료

1X TAE buffer, 증류수, Agarose gel powder, gel red, 질병진단키트

3. 실험기구

PCR 기기, DNA 전기영동 장치, UV light, gel tray, Hot plate

4. 실험방법 실험1> PCR 실험방법(질병진단)

 

1) Tap이 들어있는 PCR Tube 5개 각각의 뚜껑에 N, D, A, B, C라고 표시한다 

2) N, D, A, B, C라고 표시한 PCR tube에 정상 쥐 cDNA, 당뇨 쥐 cDNA, 당뇨 의심 쥐 A cDNA, B cDNA, C cDNA를 각각 1ul씩 넣어준 . (넣어주기 전 벽에 묻은 용액들이 아래로 떨어지게끔 잘 털어 준다)

3) DNA를 넣은 tubeGLUT4 primer F 1ul, GLUT4 primer R 1ul 각각 5개의 모든 tube에 넣어준다.

4) primer를 넣어준 PCR tubedNTP 1ul, 10X PCR tube 2ul, D.W 4ul를 각각 5개의 모든 tube에 넣어준다.

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사진1. tubeDNA, primer과 반응액을 넣어준 모습

5) PCR tube 뚜껑을 닫고 벽에 묻은 용액들이 아래로 떨어지게끔 원심분리기를 돌린다.

 

실험2> Agarose gel의 제작(1% gel)

1) 100ml1X TAE(또는 TBE 또는 SB) buffer를 삼각 플라스크에 준비한다.

* 50X TAE stock solution 제조: Tris base 242g, Glacial acetic acid 57.1ml, 0.5M ETDA 100ml 용액에 증류수를 첨가하여 최종 1L 를 만든다.(1X로 희석하여 사용)

2) 1gagarose powder를 넣은 후 전자레인지에서 완전히 용해될 때까지 끓여준다.

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사진 2. TAE buffer 용액에 agarose powder을 넣고 가열하는 모습

 

3) 5060까지 식힌 후, (pre-staining의 경우 Staining STAR, EtBr 등의 staining dyemix한 후) gel tray에 용액을 기포가 생 기지 않도록 천천히 붓고 comb을 꽂은 후 굳힌다.

 

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사진3. gel tray에 용액을 굳히는 모습

4) Gel이 굳으면(30~40분 후) comb을 제거한 후 전기영동조로 옮긴다.

실험3> 겔 전기영동의 원리와 연습

1) 마이크로파이펫으로 샘플 이동하기(연습하기)

. 마이크로파이펫의 용량을 적당히 설정하고 오염되지 않은 팁을 마이크로파이펫에 연결한다. 버튼을 1단계까지 누르고 팁을 샘플에 담근다.

. 팁이 샘플에 잠기면 버튼을 천천히 놓아 샘플을 팁으로 빨아들 인다.

 (1) 파이펫을 팁을 들어올려 겔의 홈에 이동시킨다. 이 때 팁이 홈을 상하지 않도록 조심한다.

 (2) 파이펫 버튼을 눌러 샘플을 분주시킨 후 내용물을 완 전히 비운다.

 (3) 샘플을 이동시킨 후 팁이 버퍼에서 완전히 나올 때까 지 피펫 버튼을 놓지 않는다.

. 버튼을 눌러 팁을 제거한다. 다음 샘플에는 새팁을 사용한다.

2) Gelwell에 각 sample 용액을 loading한다.

. 샘플 용량 확인 : 때로는 적은 양의 샘플이 튜브 벽면에 붙게 된다. 샘플 전체가 겔을 로딩하기 전에 튜브 끝에 위치해야 한다.

3) A ~ E 튜브에 있는 염료 샘플을 각각 순서대로 겔 홈에 로딩힌다. 이 때 로딩할 양은 35~38 ul 정도면 된다.

4) 전기영동 장치를 작동시키고 10분 후 염료가 분리되는 모습을 관찰한다.

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사진4. 전기영동 장치를 작동하기 전 모습

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사진5. 전기영동을 끝낸 샘플의 모습

 

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